能显著减低脱靶效应?Synthego正在开发下一代光控 CRISPR技术

10 月 7 日,Emmanuelle Charpentier 和 Jennifer A. Doudna 因开发精准基因编辑技术摘得 2020 年诺贝尔化学奖,这再次将基因编辑 CRISPR 置于聚光灯下(www.44662.cn)。同日,CRISPR 技术再迎重大进展,基因工程组公司 Synthego 宣布其开发出一种基础技术,能够通过光线精确控制在细胞内进行的 CRISPR 基因编辑。

官网显示,Synthego 成立于 2012 年,是一家总部位于加利福尼亚硅谷的基因组工程公司。该公司由 Paul Dabrowski 和 Michael Dabrowski 两兄弟共同创立,正式进军生物科学领域之前,他们曾就职于埃隆 · 马斯克创立的 SpaceX 公司。Synthego 正在通过机器学习,自动化和基因编辑为规模化的科学研究搭建平台。通过基因组工程推动药物发现和细胞以及基因疗法。公司的主营业务包括利用 CRISPR 基因工程化改造细胞、提供合成化 RNA 解决方案以及提供生物信息学。

图 | Synthego 业务(来源:Synthego 官网)

2020 年 8 月,该公司刚完成 1 亿美元 D 轮融资,用于加速推动其 CRISPR 平台发展。公开资料显示,Synthego 共计完成四轮超 2.5 亿美元融资,投资方不乏 8VC、英特尔、Founders Fund 以及真格等知名 VC。

近年来,CRISPR/Cas9 已经迅速发展为医学领域一种最具潜力的基因编辑工具,它是继锌指核酸内切酶以及转录激活子样效应因子核酸酶之后的又一种工程化核酸内切酶,被喻为 “基因魔剪”。但是,CRISPR 技术发展还不到十年,CRISPR/Cas9 系统在带来一系列开创性成绩的同时,也存在一系列的局限性,包括脱靶和染色体易位等。因此,众多科学家仍在优化和微调这种基因编辑方法,而 Synthego 一直在改进这种方式,属于该领域领跑者之一。

针对这些问题,Synthego 的研究人员开发出了光控 CRISPR 基因编辑的新技术 - CRISPRoff™。这项技术能通过光照使在多个基因靶标和不同细胞系中 CRISPR 基因编辑灭活,还能通过优化断开机制的时间成功地调整在靶与脱靶比率。这项研究 CRISPRoff enables spatio-temporal control of CRISPR editing 已经出版在了《自然通讯》上。

(来源:《自然通讯》)

据悉,这项研究是 Synthego 与美国国家标准与技术研究所(NIST)基因组编辑协会扩大合作,以进一步标准化基因编辑在疾病治疗中的精确性和可复制性。

该公司首席科学家 Robert Deans 表示:“CRISPRoff 以及与 NIST 基因组编辑协会的合作突出了我们搭建尖端 CRISPR 平台的承诺和能力,该平台将标准化在多种疾病领域的基因编辑,并推动行业向前发展。随着 Synthego 平台越来越多地支持临床试验,控制脱靶效应和优化 CRISPR 技术的能力至关重要 。”

鉴于单向导 RNA(sgRNA)是 CRISPR 系统中最容易编程的组件,Synthego 的研究人员在 sgRNA 的两个优化位置添加了邻硝基苄基,这种物质对紫外线很敏感,一旦暴露于紫外线下,它们就会断裂。在用特定波长的光照射,这种双断 sgRNA(DBsgRNA)很容易断裂。这说明一旦将 DBsgRNA 用 Cas9 转染到细胞中,它就可以正常编辑;但是置于光照下时,就会导致导向 RNA 断裂,并停止 CRISPR 编辑。

图 | CRISPRoff 机制示意图(来源:Synthego 官网)

CRISPRoff 能调控细胞中的 CRISPR 编辑。研究人员首先使用片段分析仪验证了在把 DBsgRNA 置于特定波长的光波下,DBsgRNA 会发生断裂。然后,他们比较了用 DBsgRNA 在靶点位置进行基因编辑与标准 sgRNA 的区别。在使用 ICE 分析基因组序列时,他们记录下在没有光刺激情况下插入缺失标记。分析转染后置于特定波长光波中的样品时,他们发现 DBsgRNA 无法诱导基因插入或者缺失,而标准 sgRNA 仍然起作用且不受影响。(ICE 软件可以为 CRISPR 研究人员提供高质量的基因编辑分析)

图 | CRISPRoff 置于光照中停止基因编辑(数据显示,在不同条件下,HEK293 细胞中靶基因的编辑效率。在没有光照的情况下,DBsgRNA 和 sgRNA 的编辑效率一致。置于光线后,DBsgRNA 样品的编辑效率显著下降,而标准 sgRNA 的编辑能力却不受影响。(n = 2 个成对的实验重复,数据以平均值表示)。) (来源:Synthego 官网)

研究人员成功证明了通过 CRISPRoff 可以在细胞中进行光控 CRISPR 编辑,同时可适用于不同的基因靶点和细胞株中。

长久以来,科学家们一直在寻求降低 CRISPR 脱靶效应的方法,而 CRISPRoff 有望为最大程度地减少脱靶提供一种简便方法。在以往的研究中,科学家们已经证明了在靶编辑比脱靶编辑速度要快。基于此,Synthego 的研究人员进行了探索。他们在不同的时间点将样品置于光照下,并记录下每个样品中在靶与脱靶的比率。数据显示,如果早期照亮细胞,DBsgRNA 中在靶与脱靶的比率更高。

CRISPRoff 作为一种可编程的 CRISPRoff,可以集成到现有的 CRISPR 工作流程中,且无需优化和其他实验。该技术显著提高基因在靶编辑效率,进一步提供基因编辑技术的安全性。

相比于化学刺激,使用光学刺激的一大优势就是可以精确地控制空间。这有助于研究人员能够在单个孔中研究复杂的信号传导效应以及进一步理解特定基因在分化或类器官形成过程中所扮演的角色。他们在创建了一个表达绿色荧光蛋白基因(GFP)的细胞株,并设计了 sgRNAs 来创建 GFP 敲除表型。最终,研究人员通过敲除特定区域的 GFP,创建出了不同的空间模型。

图 | 利用靶向 GFP 的 DBsgRNAs 进行基因编辑的空间模型(来源:上述论文)

此外,Synthego 公司的基因组编辑为应对新冠疫情也做出了贡献。疫情期间,Synthego 学术界与科学家进行合作,研究 SARS-CoV-2 机制以及潜在的治疗方案。比如,通过利用先进的基因组工具,Synthego 与加利福尼亚大学旧金山分校定量生物科学研究所合作研究与 SARS-CoV-2 相互作用的人类蛋白质所扮演的角色并阐释了潜在的治疗性靶标,相关成果发表在《自然》上面;Synthego 为开发 SHERLOCK CRISPR SARS-CoV-2 快速诊断疗法提供了关键的向导 RNA 试剂,目前该疗法已经的 FDA 的批准。

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